Projekt został zatwierdzony przez Centralną Komisję Etyki Badawczej Central Oxfordshire, a wszystkie kobiety wyraziły świadomą zgodę. Przygotowanie próbek
Próbki krwi zebrano w probówkach zawierających EDTA i odwirowano przy 3000 x g, a osocze przeniesiono następnie do zwykłych probówek polipropylenowych, z ostrożnością, aby zapewnić, że kożuszek leukocytarny nie został naruszony. Kożuszek leukocytarny następnie usunięto i przechowywano w temperaturze -20 ° C aż do dalszej obróbki. Próbki osocza ponownie wirowano przy 3000 x g, a supernatanty przechowywano w temperaturze -20 ° C do dalszego przetwarzania.
Ekstrakcja DNA
DNA ekstrahowano z próbek osocza (800 .l), kożuszka leukocytarnego i płynu owodniowego (po 200 .l) za pomocą zestawu QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z protokołem dla krwi i płynów ustrojowych zalecanym przez producenta. 12 Do ostatecznego przemycia DNA z kolumny zastosowano objętość elucyjną 50 .l.
Fluorogenna analiza PCR w czasie rzeczywistym
Analiza fluorogenna PCR w czasie rzeczywistym została przeprowadzona za pomocą detektora sekwencji Perkin-Elmer (model 7700, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA), który jest połączonym detektorem termicznym i fluorescencyjnym z możliwością monitorowania postępów poszczególnych Reakcje PCR optycznie.13 Fluorogenny układ PCR RhD składał się ze starterów amplifikacji RD-A (5 CCTCTCACTGTTGCCTGCATT3 ) i RD-B (5 AGTGCCTGCGCGAACATT3 ) i sondy fluorescencyjnej o podwójnej etykiecie, RD-T (5 (FAM). ) TACGTGAGAAACGCTCATGACAGCAAAGTCT (TAMRA) 3 , FAM [6 karboksyfluoresceiny] i TAMRA [6 karboksytetrametylorodaminy] były odpowiednio barwnikiem fluorescencyjnym reporterem i wygaszaczem) .13 Startery i sonda były skierowane w stronę nieulegającego translacji regionu 3 (ekson 10) Gen RhD.3 Układ PCR .-globiny składał się ze starterów i sond do amplifikacji, jak opisano wcześniej. [0238] Sondy fluorescencyjne zawierały grupę blokującą fosforan 3 , aby zapobiec wydłużeniu sondy podczas PCR. Kombinacje starterów i sond zaprojektowano za pomocą oprogramowania Primer Express (Perkin-Elmer). Dane dotyczące sekwencji genu RhD otrzymano z bazy danych GenBank (numer dostępu, X63097).
Fluorogenne reakcje PCR ustawiono zgodnie z instrukcją producenta w objętości reakcyjnej 50 .l ze wszystkimi komponentami, z wyjątkiem sond fluorescencyjnych i starterów amplifikacji uzyskanych z zestawu odczynnika rdzeniowego PCR TaqMan (Perkin-Elmer). Sondy fluorescencyjne RhD i .-globiny zostały zsyntetyzowane na zamówienie przez Perkin-Elmer i zostały użyte w stężeniach odpowiednio 25 nM i 100 nM. Startery PCR zsyntetyzowano w Life Technologies (Gaithersburg, MD) i stosowano je w stężeniu 300 nM. Łącznie 5 .l wyekstrahowanego osocza lub płynu owodniowego DNA użyto do amplifikacji; w przypadku kożuszkowatego DNA użyto 10 ng. Amplifikacje DNA przeprowadzono na 96-studzienkowych płytkach reakcyjnych zaprojektowanych do przechwytywania danych optycznych (Perkin-Elmer).
Rozpoczęto cykle termiczne z dwuminutowym okresem inkubacji w 50 ° C, aby dać czas na działanie enzymu N-glikozylazy uracylu, który niszczy wszelkie zanieczyszczające amplikony PCR, aby działały. Po tym etapie następowała wstępna denaturacja przez 10 minut w 95 ° C, a następnie 40 cykli denaturacji w 95 ° C przez 15 sekund i ponowne zassanie i wydłużanie przez minutę w 60 ° C.
Dane amplifikacji zebrane przez detektor sekwencji i przechowywane w komputerze Macintosh (Apple, Cupertino, CA) analizowano za pomocą oprogramowania Sequence Detection System (Perkin-Elmer)
[przypisy: anastrozol, noni, wdrożenia magento ]
[patrz też: pekan, penire plus opinie, ph metria ]
