Próg detekcji ustalono na 10 SD powyżej średniej fluorescencji linii zerowej obliczonej z cykli do 15 13. Reakcja amplifikacji, w której intensywność fluorescencji wzrosła powyżej progu podczas przebiegu cykli termicznych została określona jako reakcja dodatnia. Środki antykontaminacyjne
Zastosowano ścisłe środki ostrożności dotyczące zanieczyszczenia w teście PCR.15 Końcówki do pipet odpornych na działanie aerozolu zostały użyte do obsługi wszystkich cieczy. Oddzielne obszary wykorzystano do ustawienia reakcji amplifikacji, dodania matrycy DNA i przeprowadzenia reakcji amplifikacji. Zastosowanie detektora sekwencji zapewniało dodatkowy poziom ochrony, ponieważ jego system detekcji optycznej nie wymagał ponownego otwierania probówek reakcyjnych po zakończeniu reakcji amplifikacji, minimalizując w ten sposób możliwość przenoszenia zanieczyszczeń. Ponadto, test PCR obejmował dalszą próbę przeciw zabrudzeniu w postaci obróbki przedamplifikacyjnej z N-glikozylazą uracylu, która niszczyła produkty PCR zawierające uryrol 16. W każdej analizie jako kontrole negatywne włączono wiele pustych ślepej próby.
Wyniki
System PCR RhD został użyty do genotypowania DNA z kożuszkiem leukogenowym wyekstrahowanym z 30 RhD-dodatnich dawców krwi i 30 RhD-ujemnych dawców krwi. Stwierdzono całkowitą zgodność wyników genotypowania PCR RhD z wynikami serologicznymi.
Ryc. 1. Ryc. 1. Czułość analizy PCR do wykrywania DNA RhD. Genomowy DNA od osobnika RhD-dodatniego rozcieńczono seryjnie i poddano fluorochemicznej analizie RhD w czasie rzeczywistym. Intensywność fluorescencji monitorowano optycznie podczas każdego cyklu amplifikacji.13 Wraz ze stopniowo zmniejszającą się liczbą cząsteczek docelowych, konieczne było więcej cykli amplifikacji, aby osiągnąć wykrywalny poziom fluorescencji. Końcowe rozcieńczenie (7,8 pg) odpowiadało przybliżonej zawartości DNA w pojedynczej komórce.
W celu określenia czułości fluorogennej analizy PCR RhD genomowy DNA od osobnika RhD-dodatniego rozcieńczono seryjnie zarówno w wodzie, jak iw .g genomowego DNA od osobnika z ujemnym RhD. Im mniejsza ilość DNA, tym więcej cykli amplifikacji było potrzebnych do wytworzenia wykrywalnych ilości fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych (Figura 1). Pozytywne sygnały wykryto przy użyciu tak mało DNA jak przybliżoną ilość (7,8 pg) zawartą w pojedynczej komórce Rh-dodatniej.
Wszystkie 57 kobiet ciężarnych miało ujemny wynik RhD w testach serologicznych. Analiza DNA wyekstrahowanego z próbek leukocytarnych z 45 kobiet, które były w drugim lub trzecim trymestrze ciąży, nie wykazała obecności DNA RhD, co jest zgodne z wynikami serologicznymi. Spośród 57 płodów 39 było RhD-dodatnich, a 18 było RhD-ujemnych w analizie serologicznej krwi pępowinowej lub testów PCR płynu owodniowego.
Tabela 1. Tabela 1. Wyniki genotypowania RhD płodów kobiet z niedoborem RhD z zastosowaniem testu PCR RhD. Ryc. 2. Ryc. 2. Wykrywanie płodowego DNA RhD w osoczu matki. DNA wyekstrahowane z próbek osocza od sześciu ciężarnych analizowano za pomocą systemu PCR RhD. Uczestnicy 1, 2, 4, 5 i 6 nosili płody RhD-dodatnie i wykazywali pozytywne sygnały amplifikacji, odpowiadające obecności płodowego DNA w osoczu matki.
[patrz też: bisoprolol, disulfiram, hurtownia portfeli ]
[przypisy: picie oleju lnianego, płatki jaglane właściwości, płesznik ]
