Żel osuszono i eksponowano na filmy Kodak XAR-S (Eastman Kodak, Rochester, NY). Warianty prążków jednoniciowych fragmentów DNA różniących się wzorcami migracji wycięto z wysuszonych żeli, rozpuszczono w buforze, oczyszczono kolumnami MicroSpin (Pharmacia, Freiburg, Niemcy) i ponownie amplifikowano. Te produkty PCR ponownie oczyszczono za pomocą kolumn MicroSpin i bezpośrednio sekwencjonowano cykl za pomocą metody dideoksy-terminator łańcucha z użyciem trifosforanu [35S] deoksyadenozyny i zestawu do sekwencjonowania DNA Exo (-) Pfu Cyclist (Stratagene, Heidelberg, Niemcy). Próbki poddawano elektroforezie na żelu 6,0% poliakryloamid-8,3 M (Roth), suszono i eksponowano na filmy Kodak XAR-S. Bezpośrednie wykrywanie mutacji
W celu wykrycia mutacji Glu460Stop bezpośrednio, po zidentyfikowaniu u pacjenta, zamplifikowane produkty PCR eksonu 11 genu plazminogenu (fragmenty 263-bp) strawiono MboII (New England Biolabs, Beverly, MA) według informacji producenta. zalecenia i poddane elektroforezie na 2% żelu agarozowym do analizy wzoru długości fragmentu restrykcyjnego.
Analizy laboratoryjne
Aktywność funkcjonalną plazminogenu mierzono za pomocą testu chromogennego (Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy). Antygen plazminogenu mierzono nefelometrią laserową z użyciem poliklonalnej surowicy odpornościowej królika i reagentów (Behring Diagnostics, Marburg, Niemcy). Antygen plazminogenu wykrywano również przez immunoblotting po elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem-poliakryloamidem w całym osoczu z użyciem poliklonalnej króliczej surowicy odpornościowej przeciwko ludzkiemu plazminogenowi (Behring) i przeciwciała monoklonalnego znakowanego alkalicznie fosfatazą przeciw króliczej IgG (Sigma, Deisenhofen, Niemcy). Roztwór zawierający nitrobropylowy chlorek tetrazoliowy i substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanowy zastosowano do wizualizacji przeciwciał znakowanych enzymem.
Kompleks trombina-antytrombina mierzono metodą immunoenzymatyczną (Enzygnost TAT, Behring). Testy monomerów fibryny (Enzymun-Test FM), antygenu d-dimerowego (TINAquant) i fibrynogenu przeprowadzono z użyciem odczynników Boehringer Mannheim. Funkcjonalną aktywność antytrombiny mierzono za pomocą testu chromogennego (Boehringer Mannheim).
Lys-plazminogen
Sterylny, liofilizowany koncentrat lizy-plazminogenu oczyszczony z ludzkiego osocza otrzymano z firmy Immuno (Wiedeń, Austria). Produkt był dostarczany w fiolkach zawierających 1000 CU do rekonstytucji z 10 ml jałowej wody. W przeliczeniu na mililitr, przygotowany roztwór zawiera 100 . 20 CU lizy-plazminogenu, 4 do 6 mg białka całkowitego, 7,2 do 10,8 mg chlorku sodu, 0,8 do 1,2 mg cytrynianu trisodowego, 0,14 do 0,26 mg lizyny i 0,8 mg dizasadowego cytrynianu sodu. Koncentrat ten został wykorzystany w innych badaniach klinicznych27 i nie jest licencjonowany w Niemczech. Bezpieczeństwo procesu podgrzewania pary stosowanego do inaktywacji wirusa wykazano w międzynarodowym badaniu, w którym nie stwierdzono przypadków przeniesienia wirusów zapalenia wątroby lub wirusa niedoboru odporności u ludzi. [28]
Wyniki
Ocena histologiczna
Barwienie hematoksyliną-eozyną części pseudobłonic spojówkowych ujawniło tkankę ziarnistą bogatą w fibrynę z mieszanym naciekiem okołonaczyniowym bogatym w neutrofile.
[patrz też: buprenorfina, alprazolam, wdrożenia magento ]
[przypisy: orteza na kolano, orzechy włoskie kalorie, osa a pszczoła ]
