Heterodimer p-STAT1 / p-STAT2 jest uwalniany z kompleksu IFNAR, przemieszcza się do jądra i indukuje ekspresję ISG niezbędnych do kontrolowania replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa (12). IFN-. stymulacja fibroblastów pacjenta skutkowała istotnie zmniejszoną fosforylacją STAT1 i STAT2 w porównaniu z kontrolnymi fibroblastami (Figura 2, C i D). Dodatkowo, translokacja jądra p-STAT1 była znacząco upośledzona w fibroblastach pacjenta 8 i 24 godziny po IFN-y. stymulacja (rysunek 2E). Chociaż zmutowane białko IFNAR1 * 557Gluext * 46 zachowuje miejsca dokowania wymagane do dalszych wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych, wyniki te wskazują, że dodanie potencjalnie nowych 46 aminokwasów częściowo zakłóca sygnalizację w dół receptora. W przeciwieństwie do pacjentów z niedoborem IFNAR2 lub STAT2, u których rozwinęła się śmiertelna encefalopatia szczepu odry (2, 3), nasz proband nie miał powikłań po szczepieniu MMR. Resztkowa sygnalizacja i ekspresja ISG w dół od IFNAR1 * 557Gluext * 46 w naszym probandzie mogły być wystarczające do zapewnienia odporności przeciwko atenuowanym, ale nie wirusom WT. Figura 2 Zmutowane białko IFNAR1 * 557następne * 46 zachowuje normalną ekspresję, ale ma upośledzoną sygnalizację. (A) Schemat IFNAR1 typu dzikiego i zmutowane białka IFNAR1 * 557next * 46. EC, domena zewnątrzkomórkowa; TM, domena transbłonowa; IC, domena wewnątrzkomórkowa; NS, poprzednio niescharakteryzowana sekwencja. (B) Immunoblot IFNAR1 z zastosowaniem lizatów pochodzących od fibroblastów pochodzących ze skóry kontrolnej (C) i pacjenta (Pt). (C) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej (po lewej) i kwantyfikacja (po prawej) fosforylacji STAT1 po IFN-y stymulacja fibroblastów pacjenta i kontrolnej. MFI, średnia intensywność fluorescencji. (D) Reprezentatywna immunoblot (po lewej) i oznaczenie ilościowe (po prawej) fosforylacji STAT2 po IFN-y stymulacja kontroli i fibroblasty pacjentów. * P <0,05, 2-drożna ANOVA. (E) Reprezentatywne immunobloty (po lewej) i procent p-STAT1 we frakcjach cytoplazmatycznych (C) i jądrowych (N) (po prawej) po IFN-y. stymulacja kontroli i fibroblasty pacjentów. * P <0,05, ** P <0,01, test na ucznia. Przedstawione dane pochodzą z 3 niezależnych eksperymentów, z wykorzystaniem probandu i 2 kontroli. NS, nieistotne. Następnie oceniliśmy stan antywirusowy indukowany przez IFN-y. stymulacja fibroblastów pacjenta i kontrolnej. Ponieważ fibroblasty nie wydzielają IFN-y, cytokiny wytwarzanej wyłącznie przez komórki hematopoetyczne (13), wykorzystaliśmy fibroblasty pochodzące od pacjenta w celu specyficznego określenia wpływu zmutowanego białka IFNAR1 * 557Gluext * 46 na indukcję ISG i podatność CMV niezależnie od IFN-y. IFN-. stymulacja spowodowała znaczącą upośledzoną indukcję IRF7, czynnika transkrypcji regulowanego w górę przez aktywację IFNAR, jak również IFIT1 i IFIT2, dwa ISG regulowane przez IFN typu I (12) i ważne dla hamowania replikacji CMV (Figura 3A). Bezpośrednio przebadaliśmy zdolność IFN do kontrolowania infekcji ludzkiego CMV (HCMV) u pacjenta i kontrolowania fibroblastów. Fibroblasty pacjenta i kontrolne inkubowano w pożywce z lub bez IFN-y. przez 17 godzin, a następnie zakażenie HCMV przez 6 godzin. W tym wczesnym punkcie czasowym, który występuje przed indukcją maksymalnych endogennych IFN typu I, nie było różnicy w ekspresji CMV IE1 i IE2 u nieleczonych pacjentów i kontrolnych fibroblastów (Figura 3B). IFN-. wstępne traktowanie normalnych fibroblastów zmniejszyło ekspresję CMV IE1 i IE2 do 15% poziomu w nietraktowanych komórkach (Figura 3B). IFN-. wstępne traktowanie fibroblastów pacjenta dało znacznie wyższą resztkową ekspresję IE1 i IE2 CMV, która wynosiła 40% poziomu w nietraktowanych komórkach pacjenta (Figura 3B). Częściowe zahamowanie ekspresji białka CMV w fibroblastach pacjenta przez IFN-y była zgodna z resztkową sygnalizacją w dół od zmutowanego IFNAR1 * 557Gluext * 46 (Figura 2, C i D oraz Figura 3A) [więcej w: przetoka okołoodbytnicza, pęcherzowe oddzielanie się naskórka, pole kwadratu o boku x jest równe polu czworokąta ]
